สืบ นาคะเสถียร ได้กลับเข้ามารับราชการที่กองอนุรักษ์สัตว์ป่า กรมป่าไม้ ในปี พ.ศ. 2531 และสืบได้พยายามเสนอให้ป่าทุ่งใหญ่นเรศวร และป่าห้วยขาแข้ง มีฐานะเป็นมรดกโลกอย่างเป็นทางการ จากองค์การสหประชาชาติ โดยเล็งเห็นว่าฐานะดังกล่าวจะเป็นหลักประกันสำคัญ ที่จะคุ้มครองป่าผืนนี้เอาไว้อย่างถาวร โดย ปลายปี พ.ศ. 2532 สืบได้รับทุนเรียนต่อระดับปริญญาเอกที่อังกฤษ พร้อมกับได้รับมอบหมาย ให้ดำรงตำแหน่งหัวหน้าเขตรักษาพันธุ์สัตว์ป่าห้วยขาแข้ง ซึ่งเป็นป่าอนุรักษ์ที่มีความสำคัญมากไม่แพ้ป่าทุ่งใหญ่นเรศวร ในปี พ.ศ. 2533 สืบได้จัดตั้งกองทุนเพื่อรักษาป่าห้วยขาแข้งและทุ่งใหญ่นเรศวร ได้เป็นวิทยากรบรรยาย และร่วมอภิปรายในโอกาสและสถานที่ต่าง ๆ หลายแห่ง โดยเน้นเรื่อง "การอนุรักษ์ทรัพยากรธรรมชาติและปัญหาที่เกี่ยวข้อง" และ "การอพยพสัตว์ป่าตกค้างในเขื่อนเชี่ยวหลาน"
ด้วยป่าห้วยขาแข้งเป็นผืนป่าที่อุดมไปด้วยพรรณไม้และสัตว์ป่าอันล้ำค่า ทำให้หลายฝ่ายต่างก็จ้องบุกรุกเข้ามาหาผลประโยชน์ สืบได้แสดงเจตนารมณ์อันแน่วแน่ที่จะรักษาป่าผืนนี้ไว้ให้ได้อย่างชัดแจ้ง ได้ประกาศให้รู้ทั่วกันว่า "ผมมารับงานที่นี่ โดยเอาชีวิตเป็นเดิมพัน" ตั้งแต่วันแรกที่เข้าไปรับงานหัวหน้าเขตฯ ถึงแม้กระนั้นก็ยังไม่สามารถปกป้องป่าได้ เนื่องจาก การดูแลผืนป่าขนาดมากกว่าหนึ่งล้านไร่ ด้วยงบประมาณและกำลังคนที่จำกัด รวมถึงการทุจริตของเจ้าหน้าที่ กลายเป็นปัญหาใหญ่ที่ไม่สามารถแก้ไขได้โดยง่าย และมากกว่านั้นปัญหาความยากจนของชาวบ้านที่อยู่อาศัยโดยรอบเขตรักษาพันธุ์ สัตว์ป่า ทำให้กลุ่มผู้มีอิทธิพลที่หวังผลประโยชน์ ได้ว่าจ้างชาวบ้านในเขตป่าสงวนเข้ามาตัดไม้ และลักลอบล่าสัตว์ในเขตป่าอนุรักษ์
ในทรรศนะของสืบ หนทางหนึ่งที่จะช่วยแก้ปัญหาได้คือการสร้างแนวป่ากันชนขึ้น มา โดยให้ชาวบ้านอพยพออกนอกแนวกันชน และพัฒนาแนวกันชนให้เป็นป่าชุมชนที่ชาวบ้านสามารถเข้าไปใช้ประโยชน์ได้ แต่ปรากฏว่าไม่ได้รับความสนใจและความร่วมมือจากเจ้าหน้าที่แต่อย่างใด
บ้านพักของสืบ นาคะเสถียร ที่ห้วยขาแข้ง สถานที่ที่สืบจบชีวิตลงด้วยการทำอัตวิบากกรรม
การเสียสละด้วยชีวิตเช้ามืดวันที่ 1 กันยายน พ.ศ. 2533 สืบ นาคะเสถียร ตัดสินใจจบชีวิตตัวเองลง สืบได้สั่งเสียลูกน้องคนสนิทและเขียนจดหมายสั่งเสีย 6 ฉบับ ชำระสะสางภาระรับผิดชอบ และทรัพย์สินส่วนตัวที่คั่งค้าง รวมถึงมอบหมาย เครื่องใช้ และอุปกรณ์ในการศึกษาวิจัยด้านสัตว์ป่า ให้สถานีวิจัยสัตว์ป่าเขานางรำ เพื่อนำไปใช้ตามวัตถุประสงค์ดังกล่าว ตั้งศาลเพื่อแสดงความคารวะต่อดวงวิญญาณของเจ้าหน้าที่ ซึ่งพลีชีพรักษาป่าห้วยขาแข้ง แล้วสวดมนต์ไหว้พระจนจิตใจสงบ เสียงปืนดังขึ้นนัดหนึ่งในราวป่าลึก ที่ห้วยขาแข้ง สืบ นาคะเสถียร ได้จบชีวิตของเขาลง และเป็นจุดเริ่มต้นของ "ตำนานนักอนุรักษ์ไทย สืบ นาคะเสถียร ผู้ที่รักป่าไม้ สัตว์ป่าและธรรมชาติ ด้วยกายและใจ"
สองอาทิตย์ต่อมา บรรดาเจ้าหน้าที่ระดับสูงของกรมป่าไม้ รวมทั้งผู้ว่าราชการจังหวัด นายทหาร นายตำรวจชั้นผู้ใหญ่ นายอำเภอ ป่าไม้เขต และ เจ้าหน้าที่ป่าไม้ อีกนับร้อยคน ได้เปิดประชุมเพื่อหามาตรการป้องกันการบุกรุกป่าในเขตรักษาพันธุ์สัตว์ป่า ห้วยขาแข้ง โดย สืบ นาคะเสถียร ได้พยายามจัดตั้งการประชุมหลายสิบครั้งแต่ไม่มีการตอบรับจากเจ้าหน้านี้สัก ครั้งจนกระทั่งการเสียชีวิตของสืบ ทำให้มีข้อกล่าวว่า หากไม่มีเสียงปืนนัดนั้น การประชุมดังกล่าวก็คงไม่เกิดขึ้นเช่นกัน
การจากไปของ สืบ นาคะเสถียร ได้ส่งผลสะเทือนอย่างล้ำลึกต่อผู้คนที่รักธรรมชาติ และแสวงหาความเป็นธรรมในสังคม ทั้งนี้เพราะว่าในยามที่ยังมีชีวิตอยู่ สืบมิได้เป็นเพียงข้าราชการอาชีพที่มีภาระการงานเกี่ยวกับการพิทักษ์ป่า และสัตว์ป่าเท่านั้น หากเป็นผู้นำคนสำคัญของขบวนการอนุรักษ์ธรรมชาติในประเทศไทย เป็นผู้ที่เคยต่อสู้เพื่อปกปักรักษาทรัพยากรป่าไม้ และสิ่งแวดล้อมทางธรรมชาติ โดยไม่คำนึงภัยอันตราย การจากไปของเขานับเป็นความสูญเสียครั้งยิ่งใหญ่ และเป็นความสูญเสียที่นักอนุรักษ์ธรรมชาติทุกคน ไม่อาจปล่อยให้ผ่านพ้นไป โดยปราศจากความทรงจำ